Jad węża zawiera enzymy hydrolizujące wiązania estrów karboksylowych.Substratami do hydrolizy są fosfolipidy, acetylocholina i octan aromatyczny.Enzymy te obejmują trzy rodzaje: fosfolipazę, acetylocholinoesterazę i esterazę aromatyczną.Esteraza argininowa w jadzie węża może również hydrolizować syntetyczną argininę lub lizynę, ale w naturze hydrolizuje głównie wiązania peptydowe białek, więc należy do proteaz.Omówione tutaj enzymy działają tylko na substraty estrowe i nie mogą oddziaływać na żadne wiązanie peptydowe.Wśród tych enzymów ważniejsze są funkcje biologiczne acetylocholinoesterazy i fosfolipazy, które zostały w pełni zbadane.Niektóre jady węży mają silną aktywność aromatycznej esterazy, która może hydrolizować ester etylowy p-nitrofenylu, octan a- lub P-naftalenu i ester etylowy indolu.Nadal nie wiadomo, czy aktywność ta jest spowodowana niezależnym enzymem, czy też znanym efektem ubocznym karboksyloesterazy, nie mówiąc już o jej znaczeniu biologicznym.Gdy jad Agkistrodon halys Japonicus poddano reakcji z estrem etylowym p-nitrofenylu i estrem etylowym indolu, nie znaleziono hydrolizatów p-nitrofenolu i fenolu indolu;Wręcz przeciwnie, jeśli te estry zareagują z jadem węża podgatunku kobry Zhoushan i jadem węża Bungarus multicinctus, ulegną szybkiej hydrolizie.Wiadomo, że te jady kobr wykazują silną aktywność cholinoesterazy, która może być odpowiedzialna za hydrolizę powyższych substratów.W rzeczywistości Mclean i in.(1971) donieśli, że wiele jadów węży należących do rodziny Cobra może hydrolizować ester etylowy indolu, ester etylowy naftalenu i ester butylonaftalenu.Te jady węży pochodzą od: kobry, kobry czarnoszyjej, kobry czarnowargiej, kobry złotej, kobry egipskiej, kobry królewskiej, mamby kobry złotej, mamby czarnej i mamby białowargiej (D. aw zna jeszcze grzechotnika romboli wschodniej
Jad węża może hydrolizować ester etylowy metyloindolu, który jest substratem do oznaczania aktywności cholinoesterazy w surowicy, ale jad tego węża nie wykazuje aktywności cholinoesterazy.To pokazuje, że w jadzie kobry występuje nieznana esteraza, która różni się od cholinoesterazy.Aby zrozumieć naturę tego enzymu, potrzebne są dalsze prace nad separacją.
1, fosfolipaza A2
(I) Przegląd
Fosfolipaza jest enzymem, który może hydrolizować fosforan glicerolu.W przyrodzie występuje 5 rodzajów fosfolipazy, a mianowicie fosfolipaza A2 i fosfolipaza
A., fosfolipaza B, fosfolipaza C i fosfolipaza D. Jad węża zawiera głównie fosfolipazę A2 (PLA2), kilka jadów węży zawiera fosfolipazę B, a inne fosfolipazy występują głównie w tkankach zwierzęcych i bakteriach.Ryc. 3-11-4 przedstawia miejsce działania tych fosfolipaz na hydrolizę substratu.
Wśród fosfolipaz PLA2 był badany bardziej.To może być najczęściej badany enzym w jadzie węża.Jego substratem jest wiązanie estrowe w drugiej pozycji Sn-3-glicerofosforanu.Enzym ten jest powszechnie spotykany w jadzie węża, jadzie pszczoły, jadzie skorpiona i tkankach zwierzęcych, a PLA2 występuje obficie w jadzie czterech rodzin węży.Ponieważ enzym ten rozbija czerwone krwinki i powoduje hemolizę, jest również nazywany „hemolizyną”.Niektórzy nazywają także lecytynazę hemolityczną PLA2.
Ludeeke po raz pierwszy odkrył, że jad węża może wytwarzać związek hemolityczny, działając na lecytynę za pośrednictwem enzymów.Później Delezenne i in.udowodnili, że gdy jad kobry działa na surowicę końską lub żółtko, tworzy substancję hemolityczną.Obecnie wiadomo, że PLA2 może bezpośrednio oddziaływać na fosfolipidy błony erytrocytów, niszcząc strukturę błony erytrocytów i powodując bezpośrednią hemolizę;Może również działać na surowicę lub dodaną lecytynę w celu wytworzenia lecytyny hemolitycznej, która działa na krwinki czerwone, powodując pośrednią hemolizę.Chociaż PLA2 występuje obficie w czterech rodzinach jadów węży, zawartość enzymów w różnych jadach węży jest nieco inna.Grzechotnik (C
Jad węża wykazywał tylko słabą aktywność PLA2.Tabela 3-11-11 ilustruje porównanie aktywności PLA2 10 głównych jadów jadowitych węży w Chinach.
Tabela 3-11-11 Porównanie aktywności fosfolipazy VIII 10 jadów węży w Chinach
Jad węża
Uwalnianie tłuszczu
kwas alifatyczny,
Cjumol/mg)
Aktywność hemolityczna CHU50/^ g * ml)
Jad węża
Uwolnij kwasy tłuszczowe
(^raol/mg)
Aktywność hemolityczna „(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
jedenaście
Ophis mikrocefaliczny
pięć przecinek jeden zero
kalyspallas
8. 68
dwa tysiące osiemset
smukły
V, ostry
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
trzy przecinek osiem dwa
sto czterdzieści
Bnugarus fasctatus
7,56
dwieście osiemdziesiąt
B. multicinctus
jeden przecinek dziewięć sześć
dwieście osiemdziesiąt
Viper i Russelli
siedem przecinek zero trzy
T, mucrosquamatus
jeden punkt osiem pięć
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Separacja i oczyszczanie
Zawartość PLA2 w jadzie węża jest duża i jest stabilna na ciepło, kwasy, zasady i denaturanty, dzięki czemu łatwo jest oczyścić i oddzielić PLA2.Powszechną metodą jest najpierw przeprowadzenie filtracji żelowej surowego jadu, następnie przeprowadzenie chromatografii jonowymiennej, a następny krok można powtórzyć.Należy zaznaczyć, że liofilizacja PLA2 po chromatografii jonowymiennej nie powinna powodować agregacji, ponieważ proces liofilizacji często zwiększa siłę jonową w układzie, co jest ważnym czynnikiem powodującym agregację PLA2.Oprócz powyższych ogólnych metod przyjęto również następujące metody: ① Wells et al.② Substratowy analog PLA2 został użyty jako ligand do chromatografii powinowactwa.Ten ligand może wiązać się z PLA2 w jadzie węża z Ca2+.EDTA jest najczęściej używany jako eluent.Po usunięciu Ca2+ powinowactwo między PLA2 a ligandem zmniejsza się i może ono zostać oddzielone od ligandu.Inni używają jako eluenta 30% roztworu organicznego lub mocznika o stężeniu 6 mol/l.③ Przeprowadzono chromatografię hydrofobową z PheiiylSephar0SeCL-4B w celu usunięcia śladowych ilości PLA2 w cardiotoxin.④ Przeciwciało anty-PLA2 zostało użyte jako ligand do przeprowadzenia chromatografii powinowactwa na PLA2.
Do tej pory oczyszczono dużą liczbę jadu węża PLAZ.Tu i in.(1977) wymienili PLA2 oczyszczony z jadu węża przed 1975 rokiem. W ostatnich latach co roku pojawia się duża liczba artykułów na temat oddzielania i oczyszczania PLA2.Tutaj skupiamy się na separacji i oczyszczaniu PLA przez chińskich uczonych.
Chen Yuancong i in.(1981) wyodrębnili trzy gatunki PLA2 z jadu Agkistrodon halys Pallas w Zhejiang, które można podzielić na kwaśne, obojętne i zasadowe PLA2 według ich punktów izoelektrycznych.Ze względu na swoją toksyczność neutralny PLA2 jest bardziej toksyczny, który został zidentyfikowany jako presynaptyczna neurotoksyna Agkistrodotoksyna.Alkaliczne PLA2 jest mniej toksyczne, a kwaśne PLA2 prawie nie ma toksyczności.Wu Xiangfu i in.(1984) porównali właściwości trzech PLA2, w tym masę cząsteczkową, skład aminokwasowy, N-końc, punkt izoelektryczny, stabilność termiczną, aktywność enzymatyczną, toksyczność i aktywność hemolityczną.Wyniki pokazały, że miały one podobną masę cząsteczkową i stabilność termiczną, ale miały znaczące różnice w innych aspektach.W aspekcie aktywności enzymatycznej, aktywność enzymu kwaśnego była wyższa niż aktywność enzymu zasadowego;Hemolityczny wpływ enzymu alkalicznego na czerwone krwinki szczura był najsilniejszy, następnie enzym obojętny, a enzym kwaśny prawie nie zhemolizowany.Dlatego spekuluje się, że efekt hemolityczny PLAZ jest związany z ładunkiem cząsteczki PLA2.Zhang Jingkanga i in.(1981) stworzyli kryształy Agkistrodotoksyny.Tu Guangliang i in.(1983) donieśli, że toksyczny PLA o punkcie izoelektrycznym 7,6 został wyizolowany i oczyszczony z jadu Vipera rotundus z Fujian, a jego właściwości fizyczne i chemiczne, skład aminokwasowy i sekwencja 22 reszt aminokwasowych w N -terminal zostały określone.Li Yuesheng i in.(1985) wyizolowali i oczyścili inny PLA2 z jadu Viper rotundus w Fujian.Podjednostka PLA2* wynosi 13 800, punkt izoelektryczny 10,4, a aktywność właściwa 35/xnioI/miri mg. Z lecytyną jako substratem optymalne pH enzymu wynosi 8,0, a optymalna temperatura to 65°C LD5 wstrzyknięto dożylnie myszom.Wynosi 0,5 ± 0,12 mg/kg.Enzym ten ma oczywiste działanie przeciwzakrzepowe i hemolityczne.Toksyczna cząsteczka PLA2 składa się ze 123 reszt 18 rodzajów aminokwasów.Cząsteczka jest bogata w cysteinę (14), kwas asparaginowy (14) i glicynę (12), ale zawiera tylko jedną metioninę, a jej N-końcem jest reszta seryny.W porównaniu z PLA2 wyizolowanym przez Tuguanga masa cząsteczkowa i liczba reszt aminokwasowych obu izoenzymów są bardzo podobne, a skład aminokwasowy jest również bardzo podobny, ale liczba reszt kwasu asparaginowego i proliny jest nieco inna.Jad kobry królewskiej Guangxi zawiera bogaty PLA2.Shu Yuyan i in.(1989) wyizolowali z jadu PLA2, który ma aktywność właściwą 3,6 razy wyższą niż oryginalny jad, masę cząsteczkową 13000, skład 122 reszt aminokwasowych, punkt izoelektryczny 8,9 i dobrą stabilność termiczną.Z obserwacji pod mikroskopem elektronowym wpływu podstawowego PLA2 na krwinki czerwone można zauważyć, że ma on oczywisty wpływ na błonę ludzkich krwinek czerwonych, ale nie ma oczywistego wpływu na krwinki czerwone kóz.Ten PLA2 ma oczywisty wpływ opóźniający na szybkość elektroforetyczną czerwonych krwinek u ludzi, kóz, królików i świnek morskich.Chen i in.Enzym ten może hamować agregację płytek indukowaną przez ADP, kolagen i sodowy kwas arachidonowy.Gdy stężenie PLA2 wynosi 10/xg/ml ~ 100 dzbanków/ml, agregacja płytek jest całkowicie zahamowana.Jeśli jako materiał użyto wypłukanych płytek krwi, PLA2 nie mógł hamować agregacji w stężeniu 20 Mg/ml.Aspiryna jest inhibitorem cyklooksygenazy, która może hamować wpływ PLA2 na płytki krwi.PLA2 może hamować agregację płytek krwi poprzez hydrolizę kwasu arachidonowego w celu syntezy tromboksanu A2.Konformację roztworu PLA2 wytwarzanego przez jad Agkistrodon halys Pallas w prowincji Zhejiang badano za pomocą dichroizmu kołowego, fluorescencji i absorpcji UV.Wyniki eksperymentów wykazały, że konformacja głównego łańcucha tego enzymu była podobna do konformacji tego samego rodzaju enzymu z innych gatunków i rodzajów, konformacja szkieletu miała dobrą odporność na ciepło, a zmiana strukturalna w środowisku kwaśnym była odwracalna.Połączenie aktywatora Ca2+ i enzymu nie wpływa na środowisko pozostałości tryptofanu, natomiast inhibitor Zn2+ działa odwrotnie.Sposób, w jaki wartość pH roztworu wpływa na aktywność enzymu, różni się od powyższych odczynników.
W procesie oczyszczania PLA2 jadu węża oczywistym zjawiskiem jest to, że jad węża zawiera dwa lub więcej pików elucji PLA2.Zjawisko to można wytłumaczyć w następujący sposób: ① ze względu na istnienie izozymów;② Jeden rodzaj PLA2 jest polimeryzowany w różne mieszaniny PLA2 o różnych masach cząsteczkowych, z których większość mieści się w zakresie 9 000~40 000;③ Połączenie PLA2 i innych składników jadu węża komplikuje PLA2;④ Ponieważ wiązanie amidowe w PLA2 jest hydrolizowane, zmienia się ładunek.① I ② są powszechne, z kilkoma wyjątkami, takimi jak PLA2 w jadzie węża CrWa/w
Istnieją dwie sytuacje: ① i ②.Trzeci warunek został znaleziony w PLA2 w jadzie następujących węży: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, palestyńska żmija, piaskowa żmija i straszliwy grzechotnik km.
Wynik przypadku ④ powoduje, że prędkość migracji PLA2 zmienia się podczas elektroforezy, ale skład aminokwasowy się nie zmienia.Peptydy mogą zostać rozbite przez hydrolizę, ale generalnie nadal są połączone wiązaniami dwusiarczkowymi.Jad grzechotnika wschodniego zawiera dwie formy PLA2, zwane odpowiednio typem a i typem p PLA2.Różnica między tymi dwoma typami PLA2 polega tylko na jednym aminokwasie, to znaczy glutamina w jednej cząsteczce PLA2 jest zastąpiona kwasem glutaminowym w drugiej cząsteczce PLA2.Chociaż dokładna przyczyna tej różnicy nie jest jasna, ogólnie uważa się, że jest ona związana z deaminacją PLA2.Jeśli PLA2 w jadzie żmii palestyńskiej będzie utrzymywany w cieple z surowym jadem, grup końcowych w cząsteczkach enzymu będzie więcej niż wcześniej.Z C PLA2 wyizolowany z jadu węża ma dwa różne N-końce, a jego masa cząsteczkowa wynosi 30000. Zjawisko to może być spowodowane asymetrycznym dimerem PLA2, który jest podobny do symetrycznego dimeru utworzonego przez PLA2 w jadzie wschodniego grzechotnika rombowca i zachodni grzechotnik diamentopodobny.Kobra azjatycka składa się z wielu podgatunków, z których niektóre nie są bardzo określone w klasyfikacji.Na przykład to, co kiedyś nazywano podgatunkiem Cobra Outer Caspian, jest teraz rozpoznawane
Należy to przypisać zewnętrznej kobrze Morza Kaspijskiego.Ponieważ istnieje wiele podgatunków i są one ze sobą mieszane, skład jadu węża jest bardzo różny ze względu na różne źródła, a zawartość izoenzymów PLA2 jest również wysoka.Na przykład jad kobry
Co najmniej 9 rodzajów izozymów PLA2 wszystkich gatunków zostało znalezionych, a 7 rodzajów izozymów PLA2 zostało znalezionych w jadzie podgatunku kobry kaspijskiej.Durkina i in.(1981) badali zawartość PLA2 i liczbę izozymów w różnych jadach węży, w tym 18 jadach kobry, 3 jadzie mamby, 5 jadach żmii, 16 jadach grzechotnika i 3 jadach węży morskich.Ogólnie rzecz biorąc, aktywność PLA2 jadu kobry jest wysoka, z wieloma izozymami.Aktywność PLA2 i izoenzymy jadu żmii są średnie.Aktywność PLA2 jadu mamby i jadu grzechotnika jest bardzo niska lub brak aktywności PLA2.Aktywność PLA2 jadu węża morskiego jest również niska.
W ostatnich latach nie donoszono, że PLA2 w jadzie węża występuje w postaci aktywnego dimeru, takiego jak grzechotnik wschodni rhombophora (jad węża C. zawiera PLA2 typu a i typu P, z których oba składają się z dwóch identycznych podjednostek i tylko dimeraza ma
Działalność.Shen i in.zaproponowali również, że tylko dimer PLA2 jadu węża jest aktywną formą enzymu.Badanie struktury przestrzennej dowodzi również, że PLA2 zachodniego grzechotnika diamentopodobnego istnieje w postaci dimeru.Związek rybożerny
Istnieją dwa różne PLA ^ Ei i E2 jadu węża, w których 仏 istnieje w postaci dimeru, dimer jest aktywny, a jego zdysocjowany monomer jest nieaktywny.Lu Yinghua i in.(1980) dalej badał właściwości fizyczne i chemiczne oraz kinetykę reakcji E. Jayanthi et al.(1989) wyizolowali podstawowy PLA2 (VRVPL-V) z jadu żmii.Masa cząsteczkowa monomeru PLA2 wynosi 10000, który ma działanie śmiertelne, przeciwzakrzepowe i obrzękowe.Enzym może polimeryzować polimery o różnej masie cząsteczkowej w warunkach pH 4,8, a stopień polimeryzacji i masa cząsteczkowa polimerów rosną wraz ze wzrostem temperatury.Masa cząsteczkowa polimeru wytworzonego w temperaturze 96°C wynosi 53 100, a aktywność PLA2 tego polimeru wzrasta o dwa
Czas postu: 18 listopada 2022 r